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问题
OCL
体积20日,数量1,2013年1月至2月
页面(年代) 45 - 49
部分 Cheverul Mabale奖2011年
DOI https://doi.org/10.1051/ocl.2012.0487
bob电子体育竞技风暴 2013年1月15日

©John Libbey Eurotext 2013

介绍

各种酶可用于改性脂肪,油和其他脂质。这是由于它们通常优异的化学,测度和立体选择性,特别是与化学方法相比的温和反应条件。常用的酶首先是所有脂肪酶中的,而且还研究了各种磷脂酶或脂氧基酶,并施用于脂质改性。生物催化剂的应用在文献中有很好的记录(比尔曼, 2011;Bornscheuer,2000年;Bornscheuer,2003年;Bornscheuer., 2012;梅泽尔和婆罗洲,2006年;Schörken和Kempers,2009年),因此这里不作详细讨论。这篇文章着重于我自己在巴黎Journées Chevreul会议上提出的研究成果。

脂肪酶催化合成结构化甘油三酯

在脂质改性中最常使用的生物催化剂是脂肪酶(EC 3.1.1.3,三酰基甘油水解酶),因为脂肪和油是它们的天然基质(Schmid和Verger, 1998年;Jaeger,1994年)。这些酶不需要辅助因子,其中许多可以从商业供应商获得,即使在非水环境中,它们也表现出高活性和稳定性。由于脂肪酶具有明显的化学选择性和区域选择性,它们可以被用于调整天然脂质以满足营养特性,特别是对人类而言。一个例子是工业合成的可可黄油当量,主要是1,3-不饱和2-油基甘油酯。联合利华和富士油开发了以硬脂酸为酰基供体的1,3-区域选择性脂肪酶酸解廉价植物油的工艺。

结构性甘油三酯(sTAG),如可可脂等价物,在甘油主链上有不同的脂肪酸分布,是人类营养领域的重要化合物。雄鹿含中链脂肪酸sn1-和sn3位与长(优先多不饱和脂肪酸)在一起sn例如,使用诸如1,3-己酰-2-醇基 - 甘油(Cycocy)的2-位,以治疗胰腺功能不全以及快速能源供应(即,体育)。另一个重要的例子是婴儿营养中使用的Betapol™(肯尼迪,1999年)。它含有油酸sn1-和sn3位和棕榈酸sn2位(1,3-Oxyl-2-palmitoyl-甘油,OPO)。Betapol™是通过使用脂肪酶的高油e向日葵油的Tripalmitin制造的Rhizomucor miehei(Novozyme RMIM)。但是,该产品仅含有65%的棕榈酸sn2位引起婴儿不良的副作用,由于钙皂中存在的软脂酸sn1-或3位。为了获得高于简单酸化的纯度和产量,我们开发了一种优雅且可扩展的两步脂肪酶催化过程(图1)。首先,将甘油三酯(即三级素)与脂肪酶进行醇解根霉delemar并产生高度纯粹的sn2-monopalmitin。这种策略抑制了不希望的酰基迁移,这发生在水解过程中,甚至在酸解甘油三酯,导致形成sn1-或3-单拷贝对最终产品产量和纯度产生负面影响。另一个优点是sn2-单棕榈素容易结晶,因此sn2-单帕米素的收率和纯度几乎可以定量得到。在第二步,sn2-单帕米素由脂肪酶与两种等价物油酸酯化,在优良的化学和区域同分异构体纯度(96%)下产率可达70% (施密德。,1998年;施密德。,1999年)。同样的概念也成功地用于获得其他雄鹿(Soumanou。,1997年;Soumanou。,1998年)或由花生油开始。此外,与一个假单胞菌脂肪酶在最高可达80%的多不饱和脂肪酸中存在sn以金枪鱼油为原料,经醇解得到2-单甘油酯的2-位置,因此该方法对于合成高PUFA含量的牡鹿(Wongsakul。,2003年)。

缩略图 图1所示。

在两步酶促过程中以高产率和纯度获得结构甘油三酯。第一次三丙氨酸与乙醇产生脂肪酶催化的醇解,得到SN2-单钙酸,其可以通过结晶分离。在第二步中,该单甘油酯用油酸酯化,其产生所需的滞留如贝醇。

随后,我们又从1,3-二酰基甘油酯(1,3- dag)出发,开发了另一种合成路线,这种合成路线可以大规模地用于烹饪油和煎炸油,也可以从甘油和脂肪酸乙烯酯(伯杰。,1992年)。然后将这些1,3-DAG用脂肪酶酯化,其表现出不同的脂肪酸选择性,即脂肪酶不得作用于存在于中存在的脂肪酸上sn1-和sn3-位,单独催化第二种脂肪酸的引入sn第二”的位置。我们可以证明商业脂肪酶来自PseudomonasCepacia.天野之弥(PS)南极假丝酵母(Cal-B)由于其独特的脂肪酸特异性而允许合成雄鹿(Wongsakul。,2004年)。

蛋白质工程改变脂肪酶的选择性和稳定性

虽然市面上有许多脂肪酶,但这些天然酶并不总是表现出有效应用于生物催化所需的特性。这包括底物范围、区域选择性和立体选择性、pH和温度分布,但也包括稳定性(长期过程稳定性、耐有机溶剂等)。蛋白质工程可以改变这些特性,因此是现代生物催化(Bornscheuer和Kazlauskas, 2011年;Bornscheuer., 2012;Kazlauskas和Bornscheuer, 2009年;Lutz和Bornscheuer,2009年;Lutz和Bornscheuer,2012年)。蛋白质工程方法可分为两个主要概念:合理的蛋白质设计或指导(分子)进化。Rational蛋白质设计需要感兴趣的酶的3D结构(或至少是一个非常好的同性恋模型),并且在计算机程序的帮助下独立 - 通常只鉴定少数氨基酸和突变与替代氨基酸残基。这些是在实验室创建并通过实验验证。相比之下,定向演化由随机诱变组成 - 例如易于易于PCR - 导致巨大的突变文库(通常> 104-107变体),然后进行筛选或选择以找到所需的突变体。两种方法都有他们的利弊,这些利弊是文学中的良好文件。自从最近,研究人员也使用两种方法的组合,其中通过合理设计鉴定的残留物进行同时饱和诱变,导致较小的文库,但同时可以实现更高的击球率(约2010;高2008年)。

我们已经应用蛋白质工程来提高a的稳定性Rhyzopus oryzae脂肪酶(ROL)对抗醛。这些化合物形成在具有高含量的不饱和脂肪酸的植物油中,其易于氧化。因此,在植物油加工中需要稳定的脂肪酶,例如用于人造黄油生产的酯交换。首先,我们分析了ROL的3D结构,以鉴定蛋白质表面上的赖氨酸和组氨酸残基,因为已知这些与醛反应,例如,例如,如此。赖氨酸残留物将形成具有醛的Schiff碱。然后对所选的氨基酸残基进行饱和诱变,用所有其他19种蛋白质酸氨基酸替换现有的氨基酸,然后筛选Mirotiterplate(贝尔特兰。,2007年)确定更稳定的ROL变体。这是通过确定脂肪酶的水解中的残留活性来完成的p- 在酶与一系列醛孵育后丁苯基丁酸丁酸丁酸丁酸酯。每个靶向残留物约200个突变体的筛选 - 针对定向演化方法的中等数量 - 导致突变体His201ser的识别,稳定性增加60%。与突变体Lys168ile的进一步组合导致ROL稳定性的增加一倍,而特定活动不受影响(劳伦斯。,2005年,2007)。

在最近的项目中,我们针对脂肪酶的脂肪酸链选择性。自中链脂肪酸(C6- c10.)它们的相应甘油三酯(MCT)提供了快速访问它们代表有趣的食品添加剂。作为功​​能性油,它们是减肥饮食的一部分或用于临床营养。在早期的工作哈斯。应用分子建模技术鉴定脂肪酶的酰基链长度特异性的结构基础根霉delemar以及具有显著链长特异性移位的预测变异(乔尔格和哈斯,1994年;克莱林。,1997年)。Pleisset al。生成的同工酶LiP1的变体假丝酵母玫瑰脂肪酶对不同链长脂肪酸(施密特。,2002年)。

我们使用南极假丝酵母脂肪酶A (CAL-A)因其独特的cap结构域而成为脂肪酶的第一个代表。酰基结合隧道主要由这个结构域形成。为了建立对中链长度的酸具有高特异性的CAL-A变异体(C6- c12.),我们采用合理的蛋白设计阻断了CAL-A在G237位置的初级酰基结合通道(图2,)。为了实验验证这一假设,在G237位置产生了4个不同的CAL-A突变体(丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸或酪氨酸的替代,G237A/V/L/Y),并首先用p- 硝基苯基酯(PNP-酯),最后还含甘油三酯。虽然野生型cal-a对来自c的Pnp-esters显示出良好的活动4- c18.,已经突变G237A显示了长链脂肪酸的活性显着降低。特别是三个Cal-A突变体G237L / V / Y的展示非常独特的链长曲线,并且无法低于C的脂肪酸链。6。此外,G237V和G237Y在pNP-butyrate和pNP-hexanoate的水解活性比CAL-A野生型高出3倍。因此,我们可以证明,通过关闭与初级酰基结合通道G237位置的连接,可以产生对中链脂肪酸高度特异的CAL-A变体(布伦迪克, 2012)。

缩略图 图2。

左:用docked建模的CAL-A突变体G237Y的酰基结合位点p- 硝基苯甲酸盐,以说明在Cal-A结合隧道中的该介质链脂肪酸的位置(显示为线框)。螺旋Ad2中的酪氨酸取代显示为红色棒,活性位点残留物以绿色显示。右:CAL-A表示位置T221和I301的结构,对此具有最明显的影响反式-脂肪酸选择性脂肪酶。

在另一个项目中,我们的目标是创造一种具有明显选择性的脂肪酶反式-脂肪酸(TFA),它存在于部分氢化油中,已被确定为冠心病的重要危险因素。仍然有大约5%的世界植物油生产仍然受到氢化的影响,尽管诸如分馏和酯交换的替代方法在生产“零”方面获得了更多的相关性反式“食用脂肪(destaillats.。,2009年)。直到最近,还没有一种化学或酶催化剂能够高度选择性地去除部分氢化植物油(PHVO)中的TFAs。我们的出发点是一篇发表的文章,文章中表明,CAL-A在酯化癸二酸(C18.Δ9 -反式(C18.Δ9 -独联体脂肪酸)n丁醇(波道夫和沃威尔,1999年)。我们可以建立CAL-A的功能表达大肠杆菌,我们基于脂肪酶的三维结构进行了计算机建模,并检查了所有包含CAL-A ~ 30 Å长的酰基结合隧道的残基。这导致沿着整个脂肪酸结合通道识别出12个位置:F149, I150, A218, T221, F222, L225, F233, G237, L241, M248, I301和L305。然后进行个体饱和诱变,在深井板上表达后,通过pNP-elaidic酸和pnp -油酸酯筛选约5000个无性系,鉴定出具有更好选择性的突变体反式-独联体-脂肪酸。虽然在该反应系统中,野生型Cal-A水解的eLAIDIC酸-PNP-酯在2.5倍的偏好中,最佳变体是15倍的选择性。在下一步骤中,最佳突变体用于PHVO的水解,其是含有超过70种饱和的和不饱和脂肪酸的复杂混合物,其具有不同的链长,数量和构成甘油三酯的双键的数量和位置。本研究中使用的石油含有18%反式含有大约20种不同脂肪酸的脂肪酸。由于这种复杂的混合物,从脂肪酶催化水解样品的气相色谱分析。这表明CAL-A突变体T221H和I301H (图2,正确的)表现出优异的选择性并单独水解反式-和饱和脂肪酸,但没有顺式脂肪酸可以检测到,因此仍然与甘油酯部分结合。因此,这些脂肪酶变体并不区分饱和脂肪酸和反式脂肪酸,但主要区别于那些可以采用线性几何结构(饱和脂肪酸和反式脂肪酸)的脂肪酸与具有扭曲结构的顺式脂肪酸。因此,这些CAL-A变体非常适合从部分氢化植物油中去除反式脂肪酸。

其他酶在脂质改性中的应用

酶法去除3-一氯-1,2-丙烷二醇(3-MCPD)

3-MCPD是一种存在于加工食品中的有毒污染物,已经有30年的历史了。最近,由于这种化合物以脂肪酸酯的形式存在于食用油及其衍生产品中(Weisshaar 2011)。在过去几年中,在油加工过程中避免形成3-MCPD或通过物理化学治疗的去除来进行相当大的努力。我们开发了一种替代的酶促方法,可从水性和双相(植物油/水)系统中除去3-MCPD及其酯(Bornscheuer和Hesseler, 2010)。为此,3-MCPD由由卤代醇脱氢酶组成的酶级联转换arthrobacter sp.AD2和环氧化物水解酶农杆菌属radiobacterAD1。脱氢酶将3-MCPD转化为相应的缩水甘油,然后通过环氧化物水解酶定量地将其定量地水解成无毒甘油(图3)。该方法不仅用于去除3-MCPD,而且还与南极假丝酵母脂肪酶A和相应的油酸单酯可以有效地转化为甘油。此外,反应发生在低浓度的水(植物油中只有5%)下,以方便大规模使用(Bornscheuer和Hesseler, 2010)。

缩略图 图3。

脂肪酶、脱卤酶和环氧化物水解酶的组合可用于有效地将加工植物油中存在的有毒污染物3-单氯丙二醇(3-MCPD)或其脂肪酸酯转化为无害的甘油。

酶脱胶用磷脂酶C的发现

磷脂酶分为四组(PLA1,中国人民解放军2PLC和PLD)取决于它们在磷脂分子上的作用位置。中国人民解放军1和解2几十年来被大规模用于天然脂肪和油脂的脱胶(去除磷脂)。早期的过程使用了一种哺乳动物磷脂酶从猪胰腺特异性sn2 - 位置(PLA2),但这种方法后来被一种从尖孢镰刀菌,展品sn1-selectivity (PLA1)。最近,Novozymes的研究人员通过脂肪酶脚手架和部分的蛋白质工程产生了一种嵌合酶镰刀菌素酶。这两种酶的作用释放溶血磷脂,易于水合,因此允许将磷脂含量的降低至<10ppm。另一种替代方案是使用特异性水解磷脂中C-O-P键的磷脂酶C(PLC,EC 3.1.4.3),屈服sn-1,2(2,3) - 甘油酯和含有相应头组的磷酸盐残余物。该过程具有以下优点:没有破坏损失并且磷酸盐的去除可以与PLA一样有效1或中国人民解放军2。Verenium公司(现在的DSM,圣地亚哥,美国)最近大规模建立了基于plc的流程。在一个项目中,我们也发现了一系列的PLC经过筛选芽孢杆菌可实现PLC的功能表达枯草芽孢杆菌(2007年德班)用于脱胶。PLC的生化表征需要可靠的活性测定方法。为此,我们开发了一种测定方法,在该方法中,PLC释放的磷酸残渣被碱性磷酸酶裂解。形成的磷酸盐然后用n- 丁醇并量化为磷钼酸盐复合物。该方法的适用性被证明在含有不同头组的一系列磷脂中的10nm至10mm的浓度范围,即使用粗糙的未纯化PLC()也可以可靠地使用2007 b德班)。

结论

本文中总结的例子表明,由于酶具有优异的区域选择性和化学选择性,酶是非常有用的脂质修饰催化剂。此外,生物催化反应的结果可以通过仔细控制反应条件来优化——如两步合成结构化甘油三酯——或者可以通过蛋白质工程的方法来定制酶。

披露

利益冲突:无。

致谢

我特别感谢Société Française为脂质练习题(SFEL)为他们与2012年雪佛尔奖牌的研究成果的认可。我还要感谢来自我集团的许多有才华的研究人员,为各种项目促进脂质改性的酶促改性。

参考

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引用这篇文章:Bornscheuer UT。脂质修饰中的酶:从商用酶的经典生物催化到先进的蛋白质工程工具。OCL2013;20(1): 45-49。doi:10.1051 / OCL.2012.0487

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缩略图 图1所示。

在两步酶促过程中以高产率和纯度获得结构甘油三酯。第一次三丙氨酸与乙醇产生脂肪酶催化的醇解,得到SN2-单钙酸,其可以通过结晶分离。在第二步中,该单甘油酯用油酸酯化,其产生所需的滞留如贝醇。

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缩略图 图2。

左:用docked建模的CAL-A突变体G237Y的酰基结合位点p- 硝基苯甲酸盐,以说明在Cal-A结合隧道中的该介质链脂肪酸的位置(显示为线框)。螺旋Ad2中的酪氨酸取代显示为红色棒,活性位点残留物以绿色显示。右:CAL-A表示位置T221和I301的结构,对此具有最明显的影响反式-脂肪酸选择性脂肪酶。

在文本中
缩略图 图3。

脂肪酶、脱卤酶和环氧化物水解酶的组合可用于有效地将加工植物油中存在的有毒污染物3-单氯丙二醇(3-MCPD)或其脂肪酸酯转化为无害的甘油。

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